中性粒细胞弹性酶抑制剂可以预防博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化

　　前 言

　　2012年来自日本獨協医科大学肺医学与临床免疫学专业的Yoshiki Ishii教授团队于《European Respiratory Journal, IF=16.6》杂志发表了题为：中性粒细胞弹性酶抑制剂可以预防博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化文章。该文表明：

　　①西维来司他钠减少了BLM诱导的肺部总胶原蛋白的产生，显著阻止了肺纤维化。

　　②西维来司他钠显著减少了BLM诱导的BALF内第7和14天炎症细胞数量升高，阻止了肺部炎症细胞的募集。

　　③每日应用西维来司他钠显著降低了BLM组BALF和肺匀浆样品内中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)第7和14天的活性。

　　④西维来司他钠可抑制中性粒细胞炎症、TGF-β1活性和pSmad2水平升高，从而抑制BLM诱导的肺纤维化。

　　文章摘要

　　中性粒细胞弹性蛋白酶在肺纤维化的发病机制中起关键作用。中性粒细胞弹性酶抑制剂西维来司他钠可减轻肺纤维化。但抗纤维化的机制尚不清楚。本文研究了抗纤维化机制，主要关注关键的纤维化细胞因子转化生长因子(TGF)-β1。为阐明西维来司他钠抗纤维化的机制，我们构建了博莱霉素诱导的早期肺纤维化模型小鼠，气管内滴注博来霉素后，每日腹腔注射西维来司他钠1次，连用7或14天。在博莱霉素滴注后第7天或第14天检查支气管肺泡灌洗液和肺标本。在博莱霉素诱导的早期肺纤维化模型中，肺内中性粒细胞弹性酶水平升高。西维来司他钠显著抑制博莱霉素诱导的早期肺纤维化中胶原含量增加、纤维化改变、总细胞(包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞)数量、TGF-β1和p-Smad2活性水平升高。然而，西维来司他钠没有显著降低TGF-β1总水平和TGF-β1 mRNA表达的水平。这些结果表明，西维来司他钠通过抑制肺内TGF-β活化和炎症细胞募集来减轻博来霉素诱导的肺纤维化。

　　简 介

　　肺纤维化是由多种肺损伤因素引起的病理性变化，如急性肺损伤、辐射和药物。纤维化程度是纤维化性肺病患者临床预后的主要决定因素，目前治疗方法无效或仅略微有效。急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)与急性和弥漫性肺泡损伤、非心源性肺水肿和随后的肺纤维化有关。最近观察性研究中ARDS患者的死亡率为40-45%，随机对照试验中为35-40%。肺实质纤维化程度和肺功能丧失是影响ARDS患者长期生存的重要因素。

　　ALI/ARDS的纤维增生期传统上被认为是晚期事 件。但最近研究表明，胶原蛋白增加是一个早期事 件，发生在诊断后24小时内。广泛的薄层计算机断层扫描异常，包括牵引性细支气管扩张，提示纤维增生性改变是ARDS患者发病后7天内预后不良的独立预测指标。转化生长因子(TGF)-β，尤其是其异构体TGF-β1，是一种在纤维化患者中过表达的促纤维化细胞因子，在多种人类环境和动物模型中与纤维化直接相关。不仅在支气管肺泡灌洗液(BALF)中发现活性TGF-β1水平升高，在ARDS诊断后24小时内组织样本中也发现活性TGF-β1水平升高。

　　ARDS病程早期出现纤维化改变与死亡风险增加有关。肺损伤早期反应中的纤维增生可能是一个重要的治疗靶点。特发性肺纤维化(IPF)也是一种进行性和致死性纤维化肺疾病，目前尚无有效的治疗方法。博莱霉素(BLM)诱导的炎症和纤维化是IPF以及ALI/ARDS的实验模型。最近研究表明，在BLM诱导的纤维化中，胶原增加和纤维化改变是14天内的早期事 件，这些变化通常被用作肺纤维化模型。BLM给药后7天观察到纤维化迹象。早在第8天就观察到总胶原沉积显著增加，并持续增加至第16天。因此使用BLM诱导模型作为14天内的早期纤维化模型。

　　中性粒细胞弹性酶(NE)是一种丝氨酸蛋白酶，从活化的中性粒细胞释放，具有广泛的底物特异性。NE被认为通过其对细胞外基质的蛋白水解在退行性和炎症性疾病中发挥作用，并有助于肺损伤。NE通过蛋白酶激活受体(PAR)-1诱导肺上皮细胞凋亡，PAR-1可能在ALI/ARDS炎症和纤维增殖反应中发挥重要作用。肺纤维化患者血清NE水平升高，一些证据确实表明抑制其活性可以减轻疾病的发展。

　　本研究中检测了一种特异性NE抑制剂西维来司他钠的抗纤维化作用，主要是对BLM诱导的早期肺纤维化模型中TGF-β1的激活。我们发现西维来司他钠通过抑制TGF-β1激活和肺部炎症细胞募集来减轻BLM诱导的肺纤维化。结果表明，西维来司他钠不仅可以减轻IPF以及ALI/ARDS的炎症，还可以减轻纤维增殖。

　　结 果

　　BLM诱导的肺纤维化

　　组织病理学检查显示，BLM在第14天诱导了肺部明显的炎症细胞浸润和纤维化(图1c、g和i)。在BLM诱导的小鼠中，西维来司他钠显著阻止了BLM诱导的肺纤维化(图1d、h和i)。胶原蛋白测定表明，西维来司他钠减少了BLM治疗的肺部总胶原蛋白的产生(图1j)。非BLM处理小鼠的西维来司他钠无肺形态变化(图1b和f)及病理纤维化评分(图1i)。

　　BALF细胞分析

　　检测BALF内细胞数目和细胞分化，研究西维来司他钠对BLM诱导炎症反应的影响。在第7天和第14天，BLM升高了炎症细胞数量，包括总细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数(图2a-d)。西维来司他钠在第7天和第14天显著减少肺部炎症细胞的募集(图2a-d)。单用西维来司他钠未引起炎症细胞数量变化(图2a-d)。

　　中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性

　　BLM组BALF和肺匀浆样品在7和14天NE活性升高(图3a和b)。每日应用西维来司他钠显著降低了第7和14天的活性(图3a和b)。肺匀浆样品中的NE活性与BALF在第7天和第14天的结果相似(图3a和b)。

　　定量分析TGF-β1活性及总TGF-β1含量

　　与对照组相比，BLM组从第7天到第14天TGF-β1活性和总TGF-β1增加(图4a和b)。与BLM组相似，BLM+西维来司他钠组从第7天到第14天总TGF-β1增加(图4a和b)。与BLM组相比，BLM+西维来司他钠组从第7天到第14天TGF-β1活性形式没有增加(图4a和b)。肺匀浆样品的结果与BALF样品相似(图4c和d)。

　　TGF-β1 mRNA表达水平

　　在第7天和第14天，BLM组TGF-β1 mRNA的相对表达量明显高于对照组(图5)。BLM+西维来司他钠组TGF-β1 mRNA的表达量与BLM组相同(图5)。

　　Smad2的测量

　　P-Smad2是TGF-β1的下游信号分子，Smad2磷酸化被认为是TGF-β1信号转导的关键胞内步骤。Western blotting检测p-Smad2蛋白水平在BLM组与对照组相比显著升高(图6a)。西维来司他钠处理能显著降低BLM诱导的p-Smad2蛋白水平。p-Smad2的ELISA结果与Western blot结果相似(图6b)。

　　结 论

　　结果表明，西维来司他钠抑制NE可抑制中性粒细胞炎症和TGF-β活化，从而抑制BLM诱导的肺纤维化。 值得注意的是，ARDS中的纤维增生是多个复杂过程的叠加，很可能在损伤发生后立即开始。西维来司他钠在纤维化早期发挥作用，可能与NE活性过高有关。在这一阶段，西维来司他钠不仅能减轻炎症反应，还减轻TGF-β1激活导致的肺纤维化。尽早给予西维来司他钠，不仅可以减轻炎症，还减轻ALI/ARDS中的纤维增殖过程以及IPF的进展。

　　材料与方法

　　小鼠及分组

　　雄性C57BL/6小鼠(8-10周)被分为四组:1)气管内加腹腔内生理盐水(对照组); 2)气管内BLM加生理盐水灌胃(BLM组); 3)气管内BLM加100mg*kg-1的西维来司他钠在生理盐水中(BLM+西维来司他钠组); 4)气管内加100mg*kg-1西维来司他钠(西维来司他钠组)。BLM (5mg*kg-1)加75 mL生理盐水或单独生理盐水于第0天气管内给药。第0天BLM灌胃后3 h，使用西维来司他钠或生理盐水，每天1次，连用7-14天。牺牲后第7天和第14天取支气管肺泡灌洗液，并整体切除肺。肺标本进行组织病理学检查、胶原蛋白测定和实时荧光定量PCR。其余作为匀浆样品，所有实验均按照美国国立卫生研究院的指导方针进行。该方案由Dokkyo医科大学医学院研究动物护理小组委员会批准。

　　2. 支气管肺泡灌洗和匀浆肺标本

　　BALF中细胞计数后，用Diff-Quick染色进行细胞分类。匀浆后的肺样本和BALF上清液使用冻干机冷冻干燥。冻干样品溶解于生理盐水，测定NE活性、TGF-β1活性、总TGF-β1和p-Smad2。

　　3.NE活性

　　NE活性测定采用NE特异性底物Nmethoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val对硝基苯胺(Calbiochem, San Diego, CA, USA)进行。荧光测量波长为360nm激发和460nm发射。

　　活性和总TGF-β1定量测定

　　使用ELISA试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)测定小鼠TGF-β1活性和总浓度。

　　组织病理学评价

　　右肺固定在10%缓冲福尔马林中，苏 木 精-伊红和马松三色染色。纤维化的组织病理学分级由三名经验丰富的组织病理学家使用盲法半定量评分系统进行。

　　6. 胶原蛋白测定

　　使用Sircol胶原蛋白测定试剂盒(Biocolor Ltd, Belfast, UK)测定左肺样品匀浆中的胶原蛋白含量。

　　7.实时PCR分析

　　在ABI Prism 7700序列检测系统(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上，使用SYBR green (Roche Diagnostics, Somerville, MA, USA)作为双链DNA特异性结合染料，通过实时荧光定量PCR检测TGF-b1 mRNA的表达。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参。

　　8. P-Smad2测定

　　采用p-Smad2 (Ser465/467) (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, USA)和actin抗体(sc8432;Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)。采用Sandwich ELISA PathScan1 P-Smad2 (Ser465/467) Kit (Cell Signaling Technologies)检测P-Smad2的浓度。

　　9. 统计分析

　　数据用平均值表示。统计学显著性采用单因素方差分析或配对t检验。P<0.05认为显著差异。

　　参考文献：

　　Takemasa A, Ishii Y, Fukuda T. A neutrophil elastase inhibitor prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. Eur Respir J. 2012 Dec;40(6):1475-82. doi: 10.1183/09031936.00127011. Epub 2012 Mar 22. Erratum in: Eur Respir J. 2014 Oct;44(4):1101. PMID: 22441751.

责任编辑：柯鹏